磷(Pi)限制是制约作物生产的主要因素。为了更好地应对缺磷的压力，植物在吸收和利用磷方面已经进化出多种适应机制，包括对磷的改变生长和磷饥饿信号的激活。然而，这些策略是如何协调的，目前的研究依然十分有限。

2022年5月30日，中国农业科学院 易可可课题组在PLANT CELL上发表了名为Alternative splicing of REGULATOR OF LEAF INCLINATION 1 modulates phosphate starvation signaling and growth in plants的研究成果。

之前的研究表明，水稻的RLI1、GOLDEN2、ARR-B和Psr1 (GARP)亚家族转录因子可以调控叶片倾角，以应对不同的磷元素供应量。基因组注释和公开的RNA测序数据表明，RLI1有两种不同的转录变异。RT-PCR 和 WB结果表明RLI1有两个转录变异体，可以在水稻中产生RLI1a和RLI1b亚型。 该研究发现在磷缺乏条件下RLI1a的转录被大幅度抑制，而RLI1b受到的影响较小(图1A)。 在磷缺乏条件下RLI1a蛋白水平显著低于磷充足条件下 (图1,B和C)。然而，RLI1b蛋白水平在磷缺乏条件下显著提升，这些结果表明磷供给不足可能导致RLI1b表达上调。

图1 A, qRT-PCR分析RLI1a和RLI1b在野生型植物中的表达水平，在+ P (200 µM Pi)和-P (0 µM Pi)条件下生长。在+ P条件下生长10天的植株被转移到+ P和-P条件下再生长10天。

B，免疫印迹分析+ P和-P条件下野生型植物RLI1a和RLI1b蛋白水平。

C，图(B)中相对蛋白的定量水平;

考虑到RLI1a和RLI1b对缺磷胁迫的反应不同，以及RLI1(本研究中RLI1a)在叶片倾角中对外部磷利用能力的应激能力，我们假设RLI1a和RLI1b可能在调节叶片倾角方面发挥不同的作用。

因此，该研究在RLI1a- ox和RLI1b- ox两种植物的纵向切片上测量了叶片节理细胞长度。RLI1a- ox -3的细胞长度显著大于其他植物，而RLI1b- ox -1和WT之间没有显著差异(图2,E和F)。这些结果表明，与RLI1a不同，RLI1b不影响叶片节理细胞长度来调节叶片倾角(图2,E和F)。在-P条件下，rli1b - ox植株的叶片倾角也与WT相当。这些结果表明，PSI叶片直立性的产生与RLI1a的抑制有关，而与RLI1b的抑制无关。

图2 E, WT、rli1、RLI1a-Ox-3、RLI1b-Ox-1植株第2叶顶叶层节纵向剖面图。比例尺，50 µm。F，叶片节理细胞长度。值表示平均值±SD (n = 30-50)。

水稻RLI1b-Ox品系表现为叶尖坏死，是磷中毒的典型症状。出乎意料的是，RLI1a-Ox也显示叶尖坏死(图3A和图4A)。通过对这些过表达系中磷含量的测量，证实了在磷充足条件下，RLI1a-Ox和RLI1b-Ox植株的地上部磷积累高于野生型，而在磷匮乏条件下这些差异显著缓减小(图4,B和C)。这些结果表明，RLI1a和RLI1b在水稻中都具有调控磷积累和调节磷匮乏信号的功能。

图3 A水培条件下WT、RLI1a过表达系(A - ox -3/7/10)和RLI1b过表达系(b-Ox-1/9/12)的表型表现分析。

图4A, WT与RLI1a过表达株系(A - ox -3/7/10)和RLI1b过表达株系(b-Ox-1/9/12)叶片的表型表现。在充足磷 (HP, 200 µM Pi)和缺乏磷 (LP, 5 µM Pi)条件下生长30天。主分蘖顶部的第三片叶子用于分析。B和C, 在HP和LP条件下WT, a-Ox和b-Ox的磷的测量值。FW表示新鲜重量。值表示平均值±SD，重复3次。

鉴于RLI1a和RLI1b对R1BS (RLI1a binding site, NAKATNCN)和P1BS(PHR1 binding site,GNATATNC) 表现出不同的DNA结合亲和力，假设RLI1a和RLI1b可能在体内优先靶向不同的基因。为了验证这一假设，我们对35SRLI1a-FLAG和35S-RLI1b-FLAG苗期植株采用CUT&Tag技术进行了基因组表观分析，然后进行了高通量测序。测序数据显示，与RLI1b相比，RLI1a在体内结合更多的DN**段，有11417个DNA结合峰值，而RLI1b只有3415个峰值(图5,A和B)。其他候选靶基因相关序列位于峰值的上游3k bp内至下游1k bp处。正如转录因子所期望的那样，RLI1a和RLI1b经常结合在基因的转录起始位点(TSSs)附近。RLI1a靶向6716个基因，而RLI1b只靶向水稻基因组中的2884个基因(图5C)。其中2047个基因是RLI1a和RLI1b的共同靶基因，4669个基因和837个基因分别是RLI1a和RLI1b的共同靶基因(图5)。这些结果表明，在体内RLI1a比RLI1b具有更广泛的靶基因范围。

图5 在体内，RLI1a比RLI1b具有更广泛的靶标。A、RLI1a和RLI1b在染色体不同位置的峰数。从含有RLI1a-FLAG和RLI1b-FLAG的转基因植物的嫩枝中分离细胞核，使用CUT&Tag试剂盒(NovoNGS)进行ChIP-seq分析。B, RLI1a和RLI1b靶向的峰总数。误差条为SD (n = 2)。C，表示RLI1a和RLI1b靶向基因重叠的Venn图。这些数字代表RLI1a或RLI1b直接靶向的基因数量。BR生物合成和信号转导相关基因或磷内稳态和信号转导相关基因。

该研究中使用的CUT&Tag试剂盒来自近岸蛋白，近岸蛋白的NovoNGS^® CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit已助力多篇高分文章发表，是您表观遗传研究的得力助手！

CUT&Tag相关产品

考虑到RLI1a而非RLI1b调控叶片倾角，且在RLI1a ChIP-Seq数据中检测到许多BL生物合成和信号基因，我们推测，RLI1a直接调控 brassinolide （BL）相关基因的表达，从而调节BL含量和信号，从而影响水稻生长。为了验证这一假设，我们设计了针对BL生物合成基因启动子(D11、DWF4、BZR1)的特异性引物，并将其用于ChIP-qPCR分析。和阳性对照相似，在D11、DWF4和BZR1 pro位点检测到显著富集的RLI1a- flag而非RLI1b- flag(图6A)，表明RLI1a与这些启动子结合，可能影响D11、DWF4和BZR1在体内的表达。

图6 A, ChIP-qPCR分析D11、DWF4、BZR1、BU1启动子上RLI1a和RLI1b的表达水平。

另外，与不同品系间BL含量的差异以及激活BL信号的是RLI1a而不是RLI1b的观点一致，在对照条件下以及在BL和brassinazole (BRZ，一种BL生物合成特异性抑制剂tor)处理下，RLI1b- ox的叶片倾角与WT相似。这些结果表明，RLI1a直接调控BL生物合成基因的表达，从而调节BL内稳态和信号转导，进而影响水稻生长。

该研究还从20种具有代表性的陆地植物中构建了MYBCC蛋白的系统发育树，并在被子植物中发现了RLI1特异的分支。对这支枝的基因进行结构分析，预测大多数基因会发生类似的AS类型与水稻RLI1类似，在拟南芥、大豆和玉米中检测到两个编码假定的MYB和MYB- cc蛋白的转录亚型。这些结果表明，RLI1样基因的AS在双子叶和单子叶中都是保守的。

近岸蛋白相关产品

苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，是一家专注于重组蛋白应用解决方案的高新技术企业，主营业务为靶点及细胞因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售，并提供相关技术服务。公司定位为医疗健康与生命科学领域原料与技术解决方案的上游供应商，致力于为下游客户提供及时、稳定、优质的产品及服务，助力全球生物医药企业和研究机构的技术与产品创新升级。

访问www.novoprotein.com.cn或致电400-600-0940。