毕赤酵母细胞应用及其残留DNA质控

毕赤酵母是第二代酵母表达系统，能够将甲醇作为唯一碳源，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等。

毕赤酵母表达系统在多个领域中都有广泛的应用。其中，医药领域是应用最广泛的领域之一。首先，毕赤酵母表达系统可用于生产各种重组蛋白药物。目前该表达系统已有15种被FDA批准上市的蛋白质药物，如Cervarix疫苗、细胞因子 IFN-γ、GM-CSF 等。这些药物又广泛用于预防与治疗肿瘤、炎症、自身免疫病等疾病；其次，毕赤酵母表达系统也可用于酶工业生产。由于毕赤酵母菌株具有高效的蛋白质分泌能力，所以毕赤酵母表达系统广泛应用于工业发酵中，尤其是酶制剂的生产中。尽管在毕赤酵母在生产过程中已有残留DNA的去除工艺，但疫苗产品中仍有可能残留宿主DNA及其片段。所以毕赤酵母检测项目是生物制品生产工艺中重要的质量检测指标之一。

残留DNA风险及法规监管要求

中国药典2020版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质（酵母、大肠杆菌等）表达的生物制品中DNA残留量不超过10 ng/剂。

美国FDA发布的指导原则中指出生物制品宿主细胞DNA残余限度为100 pg/剂，对于大剂量生物制品如单克隆抗体，根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10 ng/剂。

欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂，但对个别疫苗的残留DNA限定标准更严格，如甲型肝炎灭活疫苗中的DNA残留量不得超过100 pg/剂，乙型肝炎疫苗中的DNA残留量不得超过10 pg/剂。

残留DNA检测方法

《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，外源性DNA残留检测采用DNA探针杂交法、荧光染料法和定量PCR法。目前市场上对宿主细胞残留DNA检测，主要采用荧光探针qPCR方法，qPCR法具有极高的灵敏度、序列特异性和准确性，可为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段，现也已成为各生物制品厂家首选检测方法。

翌圣生物依托相关法规，从市场需求出发，自主研发了毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒。该试剂盒可快速准确定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中毕赤酵母残留DNA残留量。还研发了与毕赤酵母残留DNA检测试剂盒配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。

毕赤酵母残留DNA检测Kit产品性能

灵敏度高：检测下限可低至3 fg/μL；

准确性高：DNA参考品与国家标准物质标曲基本无偏差，检测值CV＜5%；

精密度高：重复性CV值＜10%，好于行业标准（15%），中间精密度＜15%；

专属性强：不同细胞系间无交叉反应；

定量准确：配套专属磁珠法样本前处理试剂盒；

操作时间短：3小时内完成全部检测流程；

稳定性好：多次反复冻融扩增效率仍较高，-20℃可储存2年。

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