一、 DNA甲基化

1.什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(Dnmt)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的过程。

2.DNA甲基化与基因表达调控

DNA复制后胞嘧啶的甲基化会改变DNA的构象，使DNA的大沟无法与DNA结合蛋白正常结合，从而使这些非编码区长期保持无表达活性的状态。而有转录活性的基因可利用非甲基化的启动子来进行转录表达。

3.DNA甲基化主要发生在CpG位点

CpG位点（CpG sites）是指DNA的某个区域，其上的碱基序列以胞嘧啶接着鸟嘌呤出现。“CpG”是“C—磷酸—G”的缩写。 CpG位点在人类基因组上并非随机分布，在人类基因组上的频率为1%。

• DNA甲基化主要发生在CpG位点。在哺乳动物中，70%到80%的CpG位点的胞嘧啶是甲基化的。

• CpG岛是一个富含CpG位点的区域，通常定义为：一个长度至少为200bp的片段

，其GC含量高于60%，主要位于基因的启动子区（70%的基因）。

二、全基因组甲基化研究策略

优点：通量高 ，全基因组范围；单碱基分辨率。

缺点：成本高，不适于大样本研究分析；不适于特异位点、基因或区段研究。

三、特异位点甲基化研究策略

Bisulfite sequencing PCR (BSP): 基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，最后对PCR产物进行克隆并选取8-10个转化子序列，即可确定所研究的CpG区域的甲基化频率。

Methylation specific PCR (MSP) ：首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，然后针对甲基化和非甲基化引物进行PCR扩增，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。

缺点：通量太小、无法精确定量

翼和方法：

Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS)

优势：BSAS 结合了亚硫酸盐转换、靶向扩增子高通量测序技术，可实现多区段、多位点的甲基化精确定量分析。

应用：1、 适用于感兴趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、适用于在大样本中进一步确认全基因组甲基化研究挑选的阳性位点。

文献：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160

关键点-引物设计

 尽量避免CpG位点，无法避免时，可设计兼并引物；

 经亚硫酸盐处理后，两条DNA链不再互补，一般需要设计链特异性引物用于PCR扩增；

 如果只选一条链进行研究，一般选择正义链。

关键点-转换效率

亚硫酸盐处理是一化学过程，可造成DNA的损伤，很难同时实现100%的转换效率和保持DNA的完整性，二者需要做出一定的平衡。

转换效率 = 未转换碱基读数/总碱基读数 【针对DNA序列中的C位点】

如何评估转换效率？

 在植物中，叶绿体中不含甲基胞嘧啶 DNA，因此，可用叶绿体DNA序列信息作为内对照，评估转换效率。

 在动物中，可通过在试验中加入未发生甲基化的外源DNA序列（通常为噬菌体DNA）来评估转换效率；此外，还可利用CpG位点以外的C位点信息来评估。

关键点-目的片段富集

采用巢式PCR，确保目的片段有效富集

经亚硫酸盐处理后，DNA序列复杂度严重降低。应严格控制建库PCR的循环数，降低非特异性扩增。

关键点-甲基化判断

通过将参考序列中的C碱基全部替换为T碱基，然后将测序reads比对到转换后的参考序列上，针对每一个CpG位点，统计C和T碱基的读数（类似于SNP calling），来判断该位点的甲基化。

甲基化率：对于每一个CpG位点，甲基化率 = C碱基读数/该位点测序覆盖度。

甲基化状态：利用内对照得出的转换效率作为期望概率，通过二项分布统计，得到p值，判断每个CpG位点是否发生甲基化，多位点分析时，通常需要对p值进行矫正（错误发生率，FDR）。