一、实验器材及试剂
1、 实验器材
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载玻片及盖玻片 |
江苏世泰实验器材有限公司 |
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显微镜 |
奥林巴斯 BX53 荧光显微镜 |
2、 主要实验试剂
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试剂 |
厂家 |
货号 |
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多聚甲醛 |
国药集团 |
80096618 |
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浓缩型正常山羊血清（封闭） |
武汉博士德生物工程有限公司 |
AR1009 |
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荧光（Cy3）标记羊抗小鼠 IgG |
武汉博士德生物工程有限公司 |
BA1031 |
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TritonX-100 |
碧云天 |
ST795 |
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DAPI |
碧云天 |
C1002 |
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抗荧光淬灭封片剂 |
SouthernBiotech |
0100-01 |
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α-Sarcomeric actin（种属:小鼠） |
武汉博士德生物工程有限公司 |
BM0001 |
二、细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3min；
2. 用 4%的多聚甲醛固定爬片 15min，PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min；
3. 0.5% TritonX-100（PBS 配制）室温通透 20min；
4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（α-Sarcomeric actin）
并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释 好的荧光（Cy3）标记羊抗小鼠 IgG，湿盒中 20-37℃孵育 1h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5min，对标本进行染核，PBST 5min×4 次洗去多余的 DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
