硫黄素 T 检测
硫黄素 T (Thioflavin T) 是一种荧光染料，可以和富含β折叠的结构结合，例如α-突触核蛋白纤维原、Tau 纤维原等。一旦结合，硫黄素 T 的发射光谱就会发生红移 ，并且荧光强度会增强，这是一个很好的用来检测纤维原形成的测试。以下操作指南是用α-突触核蛋白前体纤维原和单体做的硫黄素 T 检测。
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用蒸馏水制备 1 mM 硫黄素 T 储备溶液 (新鲜制备并使用 0.2μm 注射器过滤器过滤)。
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用 PBS pH 7.4 稀释硫黄素 T，确保每个孔中的硫黄素 T 最终浓度为 25 μM (每孔溶液体积= 100 μL). 孔板: Lumox 96 多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024).
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在将要使用之前才把 alpha 突触核蛋白小份在室温下解冻。
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在相应的孔中加入 10 nM 前体纤维原或者 100 μM 单体 (或两者都有). 用移液器将孔中液体上下吸入排出混合. 浓度为估计值，需要优化来得到好的信号，并避免浪费.
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密封孔板然后置于震荡孵育器中 (600 rpm)，37°C 孵育.
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用 Molecular Devices Gemini XPS 微孔板读板机读取荧光读数，使用软件是 Softmax Pro 版本为 6.5.1.
XPS 酶标仪设置参数:
温度: 37°C 读取形式: 孔板扫描
波长: 激发光 450 nm，发射光 485 nm
PMT 增益: 自动
闪光每读: 6
震荡: 读数前 20 秒
7. 再次密封孔板置于震荡孵育器下 37°C.
8. 1 到 72 小时常规区间读数.
细胞检测
以下步骤是使用被活性和对照 alpha 突触核蛋白前体纤维原 (PFFs) 处理的神经元获取 ICC 图片的实验指南。活性 alpha 突触核蛋白 PFFs 处理的原代大鼠海马体神经元显示了路易体的内含形成，而经对照 alpha 突触核蛋白处理的神经元没有出现路易体形成。
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海马体神经元取自出生一天的 Sprague Dawley 大鼠幼鼠，然后接种在 PDL 和层粘连蛋白包被的孔板上，每孔 80,000 个细胞。
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前体纤维原在水浴超声波仪中处理 1 小时，然后马上进行神经元处理。
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神经元用 4 µg/mL 的前体纤维原处理。对照孔中只有转移媒介不含 alpha 突触核蛋白。
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所有板孔 7 天后经过一个 50% 基液变化。
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基液变化 7 天之后（离体处理 14 天后），所有板孔用 4% 甲醛固定 20 分钟。
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用过滤过的 10 mM PBS 洗掉甲醛，洗三次 (每次 10 分钟)。
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用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 和 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100 固定细胞 30 分钟。
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30 分钟之后, 用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀释一抗，并加入到板孔中，4℃ 下过夜孵育。
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第二天, 用过滤过的 10 mM PBS 洗掉一抗溶液 ，洗三次 (每次 10 分钟)。
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用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀释二抗，然后加入到板孔里黑暗中孵育 60 分钟。
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60 分钟过后, 用过滤过的 10 mM PBS 洗掉二抗溶液 ，洗三次 (每次 10 分钟).
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用落射荧光显微镜 (Olympus IX73, B&B 显微镜) 20X 目镜观察孔板拍照.
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所有图片都是在相同的比例和曝光时间下拍取的.
一抗: 抗-pSer129 复染色: Hoechst reagent 复染色稀释度: 1:3000 复染色孵育时间: 1 hr
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原代大鼠海马体神经元 (DIV16) 被活性小鼠突触核蛋白聚集体(SPR-324) 4 µg/ml (D-F) 处理后显示路易体内含物的形成以及细胞减少，而当被对照突触核蛋白聚集体(A-C)处理时没有路易体内含物形成及细胞减少. 组织: 原代海马体神经元. 物种: 斯普拉-道来氏大鼠. 固定: 由 PFA 制作的 3% 甲醛固定 20 分钟. 阻断: 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 以及 30 mL/mL, 0.1% triton-X 100 阻断 30 分钟. 一抗: 小鼠抗 pSer129 抗体 (1:1000), 以及兔抗 pSer129 (1:800), 4°C下处理 24 小时. 二抗: ATTO 546 驴抗小鼠 (1:700) 和 ATTO 488 驴抗兔 (1:700) 室温下孵育一小时 (复合图绿色). 复染色: Hoechst (蓝色) 细胞核染色, 1:3000 室温下孵育 1 小时. 细胞定位: 路易体内含物. 放大倍数: 20x. |
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原代大鼠海马体神经元被活性突触核蛋白聚集体(SPR-322) 4 µg/ml (D-F) 处理后显示路易体内含物的形成，而当被对照突触核蛋白聚集体(SPR-317) 4 µg/ml (A-C)处理时没有路易体内含物形成. 组织: 原代海马体神经元. 物种: 斯普拉-道来氏大鼠. 固定: 由PFA制作的 4% 甲醛. 一抗: 小鼠抗 pSer129 抗体, 稀释度 1:1000, 4°C下处理 24 小时. 二抗: FITC 羊抗小鼠 (绿色) 稀释度 1:700 室温下孵育 1 小时. 复染色: Hoechst (蓝色) 细胞核染色, 1:4000 室温下孵育 1 小时. 细胞定位: 路易体内含物. 放大倍数: 20x. |