本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT-1）试剂盒说明书
规格：100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
微量法
肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A 将酰
基转移至L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。
测定原理：
基于肉碱和脂酰辅酶A 在丙二酰辅酶A 存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作
用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶A(COA-SH)，与Ellman 试剂DN-TB 反应后，产生黄
色的TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析CPT-1 的活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制：
试剂一：液体100mL×1 瓶，
-20℃保存；试
剂二：液体20mL×1
瓶，-20℃保存；
试
剂三：液体1.5mL×1
支，-20℃保存；
试
剂四：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；试试剂
五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①
称取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或
研钵匀浆。
②
将匀浆液于600g，4℃离心5min。
③
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④
上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CPT-1（此步可选做）。
⑤
在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或
200W，超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），用于线粒体CPT-1 测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1） 在试剂五中加入1mL 无水乙醇，混匀，再加入22mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物） 或
25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
（2） 在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育5min； 用
不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（3） 在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、220μL 试剂五和10μL 试剂六，混匀，记
录412nm 处20 秒时的初始吸光度A1 和2 分20 秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
CPT-1 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V
样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g
组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/g
鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=177.8×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CPT- 1
（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.3556×ΔA V 反总：
反应体系总体积，2.4×10-4L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104L / mol /cm；d：比色皿光径，
1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500 万。
b. 使用96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V
样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g
组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/g
鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W×V 样÷V 样总）÷T=355.6×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V
样÷V 样总）÷T=0.711×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96
孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌
总数，500 万。